9 Survivin反义寡核苷酸对人肝癌细胞的抑制作用

目的:探讨survivin反义寡核苷酸（ASODN）对人肝癌细胞HepG2的抑制作用。方法:采用免疫组织化学法检测肝细胞癌（HCC）组织中survivin的表达。采用脂质体介导survivin ASODN体外转染人肝癌细胞株HepG2，Western blot检测细胞survivin蛋白的表达，FCM检测细胞的凋亡率，观察细胞在软琼脂中的集落形成能力。建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型，观察survivin ASODN的体内抑癌作用。 结果:（1）肝癌组织中survivin表达阳性率为75.8％(25/33)，明显高于癌旁组织和正常肝组织(P<0.01);（2）survivin ASODN体外转染可明显下调HepG2细胞survivin蛋白表达，ASODN组HepG2细胞凋亡率明显高于空白对照组和SODN组(P<0.01)，ASODN组HepG2细胞在软琼脂中形成的集落数目明显少于空白对照组和SODN组(P<0.01);（3）ASODN组瘤体生长速度较空白对照组和SODN组明显减慢(P<0.01)，ASODN组瘤体重量较空白对照组和SODN组明显减轻(P<0.05)。结论:Survivin在HCC组织中高表达;survivin ASODN可以诱导HepG2细胞凋亡，在体外实验和动物实验中对HepG2细胞生长都有抑制作用。     

胃癌腹腔冲洗液多巴脱羧酶mRNA的检测

目的：通过检测胃癌腹腔冲洗液中DDCmRNA的表达，探讨多巴胶羟酶（DDC）与胃癌腹膜转移的关系，并为胃癌腹膜转移预测和亚临床转移的筛检提供新的方法．方法：用RNA提取和RT-PCR方法检测92例胃癌腹腔冲洗液中DDCmRNA的表达，同时做腹腔冲洗细胞学（PLC）检查；10例良性疾病的腹腔冲洗液作为阴性对照，结果：92例胃癌腹腔冲洗液中有57例检测到DDCmRNA的表达（62．0％），其表达阳性率与胃癌腹膜转移的PS因素密切相关（P〈0．05）；且胃癌腹腔冲洗液中DDCmRNA的表达水平还与胃癌浸润深度、浆膜类型、PLC检查结果以及是否存在肉眼腹膜转移有关，浸润深度深、浆膜受侵程度重、PLC检查结果阳性及存在肉眼腹膜转移病灶者的DDCmRNA表达相对值明显升高（P〈0．05）；而10例良性疾病腹腔冲洗液均未检测到DDCmRNA的表达．结论：胃癌腹腔液中DDCmRNA的表达与胃癌腹膜转移密切相关，通过RT—PCR来检测DDCmRNA适用于胃癌腹膜转移的预测和亚临床转移的筛检。     

脂质体包裹反义核酸对调控效果和降解时间的影响

目的 观察脂质体Dotap包裹反义脱氧寡核苷酸对酪氨酸酶(TYR)的调控效果和降解时间的影响,寻找适合于临床应用的高效转染、低降解率的载体和应用方法。方法 应用DNA合成仪合成针对TYR的反义脱氧寡核苷酸,32P标记、脂质体包埋,加入黑色素细胞培养体系进行点杂交,行黑素含量、酪氨酸酶mRNA表达量检测以及降解时间的同位素液闪检测。结果 经脂质体包埋的反义脱氧寡核苷酸使细胞黑素含量由(64±2.3)pg/cell下降至(23±1.5)pg/cell,并可使基因表达水平由160%降低至82%;同位素液闪显示经脂质体包埋的反义脱氧寡核苷酸能使其半衰期由8 h延长至12 h。结论 脂质体可以明显增强反义核酸的调控效果,并可延长其作用半衰期。     

外源性p53对Wnt通路抑制因子Dickkopf-1的表达作用

目的研究外源性p53对W nt通路抑制因子D ickkopf-1(DKK-1)的表达作用。方法将携带p53基因的复制缺陷型腺病毒载体(Adp53)导入到p53完全缺失的人肝癌细胞株Hep3B中,并以p53反以寡核苷酸阻断p53阳性细胞p53的表达,以W nt通路的关键因子-βcaten in的改变为功能指标评价W nt通路的变化。以RT-PCR技术检测W nt通路抑制因子DKK-1表达的调节作用,以流式细胞术检测Adp53的转基因情况,肝癌细胞中p53和β-caten in的表达。结果DKK-1mRNA水平在转染Adp53 20 h后即有明显升高,32 h达最高水平,随后逐渐降低。β-caten in表达水平随着转染时间和转染剂量的增加,阳性细胞百分比强度和平均荧光量强度表达水平逐渐下降。以p53反以寡核苷酸阻断p53阳性细胞p53表达后,抑制剂DKK-1的表达逐渐降低,-βcaten in表达水平逐渐增加。结论外源性p53能明显诱导W nt通路抑制剂DKK-1的表达,进而产生抑制W nt通路的作用。     

幼兔缺血预处理在心肌保护第二窗期对未成熟心肌Bcl-2基因mRNA表达的影响

目的　观察幼兔心脏缺血预处理 2 4h对未成熟心肌缺血 /再灌注后Bcl -2mRNA表达的影响 ,探讨未成熟心肌保护第二窗形成的作用机理。方法　 18只 3～ 4周龄幼兔 ,随机分为 3组 ,每组 6只 :Ⅰ组 ,正常对照组 ;Ⅱ组 ,缺血 /再灌注损伤组 ;Ⅲ组 ,缺血预处理组。建立活体心脏缺血 /再灌注损伤模型 ,Maclab/8s系统监测左心室发展压 (LVDP)、左室压上升及下降最大速率 (+dp/dtmax,-dp/dtmax)变化 ,原位免疫杂交 (ISH)方法检测心肌细胞内Bcl-2mRNA的表达。结果　缺血再灌注前 ,各组间LVDP、±dp/dtmax无显著性差异 (P >0 .0 5) ;再灌注 1h后 ,Ⅱ组的LVDP、+dp/dtmax和 -dp/dtmax恢复率分别为 (42 .81± 12 .56) %、(3 0 .67± 16.2 2 ) %和 (2 9.49± 10 .13 ) % ;Ⅲ组LVDP、+dp/dtmax及 -dp/dtmax恢复率分别为 (84.15± 13 .56) %、(69.49± 10 .3 6) %和 (58.3 7± 12 .45) % ,两组间有显著性差异 (P <0 .0 1)。Ⅱ组、Ⅲ组Bcl -2mRNA表达阳性细胞面积百分数分别为 (8.3± 2 .5) %、(76.3±13 .5) % ,两组间有显著性差异 (P <0 .0 1)。结论　缺血预处理可上调Bcl -2mRNA表达 ,参与未成熟心肌保护第二窗的形成 ,促进未成熟心肌缺血 /再灌注后心室功能恢复     

胃癌腹腔CEA和CK-20mRNA检测的研究进展

胃癌是严重威胁我国人民健康的恶性肿瘤之一，尽管目前胃癌治疗多采用以手术为主的根治术，但是转移和复发仍然是影响胃癌患者预后的重要因素，尤其是患者腹腔的极少量游离癌细胞，往往是导致胃癌复发和微转移的基础。由于脱落的游离癌细胞数量少，浓度低，使得传统的细胞学检测方法十分有限。     

survivin反义寡核苷酸诱导胃癌原代细胞凋亡的实验研究

目的探讨survivin反义寡核苷酸对人胃癌原代细胞凋亡的影响，为胃癌的靶向治疗提供实验依据。方法利用人胃癌实体瘤新鲜标本培养胃癌原代细胞，胃癌细胞分为空白对照组、脂质体组、正义寡核苷酸组及反义寡核苷酸转染组。用脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染胃癌原代细胞，48h后，观察肿瘤细胞的形态变化，Westernblot检测survivin蛋白的表达，流式细胞术检测细胞的凋亡。结果反义寡核苷酸转染组肿瘤细胞体积变小，细胞碎裂，出现凋亡小体；survivin蛋白量下降；流式细胞术检测到肿瘤细胞的凋亡率增高。与其他各组相比，其差异有统计学意义（P〈0．05），而空白对照组、脂质体组、正义寡核苷酸组之间的差异无统计学意义（P〉0．05）。结论survivin反义寡核苷酸在脂质体介导下转染人胃癌原代细胞，可以诱导肿瘤细胞发生凋亡，抑制细胞生长，反义survivin可能成为一个促进胃癌细胞凋亡的手段。     

Effect of nuclear factor-κB p65 ASOND on I typ collagen expression and rat hepatic stellate cells proliferation

Objective Sstudy effect of nuclear factor-κB ASOND on I type collagen expression and rat hepatic stellate cells(HSC)proliferation.Methods Rat HSCs were separated by affusing and digestingof Ⅳ type collagenenzyme and density acentric method.Lipid-mediated NF-κB p65 ASOND(0.001,0.01,0.1,1μmol/L)Was transferred into rat HSCs.Toxicity of HSCs caused by NF-κB p65 ASOND and activity of LDH were determined by trypan blue staining.Proliferation affection of transferring NF-κB p65 ASOND into HSCs was determined by MTT.In different concentration NF-κB p65 ASOND.expression of Ⅰ type collagen stimulated by 1mg/L TNF-αwas determined by RT-PCR and ELISA.Results After transfection of NF-κB p65 ASODN,expression of NF-κB protein in HSCs was decreasing.Toxicity experiment indicated that NF-κB p65 ASOND of different concentration(0.001,0.01,0.1 and 1.0 μmol/L)had no effect on HSCs livability and LDH activity(P<0.05).Four different concentration NF-κ B p65 ASOND could restrain HSCs proliferation stimulated by 1 mg/L TNF-α.The expression of I type collagen and mRNA stimulated by 1mg/LTNF-αwas increased,and had a positive correlation with concentration(P>0.05).Conclusion NF-κB p65 ASOND may depress NF-κB activity to restrain HSCs proliferation and Ⅰ type collagen expression,and reduce extracellular matrix.     

Rb1基因第16内含子内21个碱基缺失1例

目地研究双眼视网膜母细胞瘤患者Rb1基因杂合性突变的分子生物学特性。方法应用PCR—SSCP直接测序技术检测双眼视网膜母细胞瘤患者白细胞DNA中Rb1基因杂合性突变。结果50例证实有Rb1基因杂合性突变的病例中有1例发生于第16内含子中可以用3种定位方法解释、具有相同序列的21个碱基缺失。结论这种极为少见的Rb1基因突变方式可能是由于破坏了正常拼接位点的结构而激活了“隐蔽拼接位点”，导致异常的Rb1基因mRNA产生或由此影响整个拼接过程。     

反义P^53基因对人肺癌细胞生长蛋白表达的影响

Ｐ＾５３基因的突变浊肿瘤发生的重要事件之一，利用能表达反义Ｐ＾５３基因的逆转录病毒载体导入人肺癌细胞系ＧＬＣ－８２细胞，抑制其突变的Ｐ＾５３基因表达。并与导入的空载体ＰＤＯＲ－ｎｅｏ和未导入的ＧＬＣ－８２细胞作比较，用ＤＮＡ杂交证实重组子转入细胞，通过细胞生长曲线观察细胞生长情况，利用免疫组化法和流式细胞仪测定观察Ｐ＾５３蛋白表达，结果表明，反义Ｐ＾５３基因对ＧＬＣ－８２细胞生长速度及突变的Ｐ＾５